Genome Biology：肠道微生物+宿主甲基化测序+宿主转录组测序的联合应用

英文题目： Exposure to the gut microbiota drives distinct methylome and transcriptome changes in intestinal epithelial cells during postnatal development

中文题目：肠道微生物在出生后发育过程中驱动肠上皮细胞明显的甲基化和转录组改变

发表杂志：Genome Medicine

影响因子：8.89

发表时间：2018   

背 景

表观遗传过程和肠道微生物的相互作用可能在肠道发育与稳态中发挥重要作用。以前的研究已经证实，微生物在成年宿主中调节了大量的肠上皮细胞基因的转录，但在出生后早期发育过程中，微生物对DNA甲基化和基因表达的影响尚不清楚。

方 法

从5只1周（婴儿）、4周（幼年）、12-16周（成年）小鼠的小肠中收集肠上皮细胞，它们分别是在无菌和有菌条件下进行喂养，分别对这些成对样本进行DNA甲基化谱（RRBS）和上皮转录组测序（RNA-Seq），分析微生物群、基因表达和DNA甲基化之间的联系。

图1实验设计。小鼠在常规条件(CONV-R)或无菌条件（GF）生长，然后在三个发育阶段：1周、4周和12-16周处死小鼠，收集远端小肠的肠上皮细胞（IEC），分离DNA和RNA，分别用RNA-seq和RRBS分析基因表达和DNA甲基化。

结 果

◆ 微生物依赖和微生物非依赖过程能共同作用于出生后发育过程中的肠上皮细胞转录组和DNA甲基化特征。

◆ 细菌对转录组的影响随着时间的推移而增加，而大多数依赖微生物的DNA甲基化差异在出生后早期就可以检测到。

图2在出生后发育过程中微生物对宿主上皮转录组的效应。A. 主成分分析显示所有样本中的总体基因表达谱。第一维度解释了63%的变异，能将1周（W1）老鼠和其他两个阶段分开。第二维度解释了8%变异，能将W4老鼠与W12／16老鼠分开，并将无菌和有菌条件培养的老鼠分开。B. 无菌和有菌条件培养的差异基因主要富集在15个转录因子。C. 微生物调控基因的聚类分析确定了12组具有特定表达谱的组分。

图4出生后发育过程和微生物对DNA甲基化谱的影响。A. 主成分分析显示所有样本中的总体DNA甲基化谱。B. 在三个发育阶段，韦恩图显示了无菌和有菌条件之间差异甲基化位点的数目。需要注意W1周差异甲基化位点数目较大。C. 无菌和有菌条件之间差异甲基化位点中高甲基化和低甲基化的位点数。D. 分别在从头甲基化和去甲基化过程中起作用的Dnmt3a和Tet3基因的表达。E. 无菌和有菌条件之间差异甲基化位点的聚类分析。每一行表示一个CpG位点，颜色代表甲基化水平。

◆ 对微生物响应的转录过程主要属于出生后发育过程中的阶段特异性细胞程序和参与免疫途径和代谢过程的相关调控基因。

图3微生物在出生后发育过程中调节不同的功能表达节点。每个点代表一个基因，颜色（红色＝上调，蓝色＝下降）表示其与平均基因表达水平的比值。列出的GO代表了该基因群的主要生物学功能。

◆ 甲基化和转录组数据的整合分析确定了126个基因组位点，这些位点的DNA甲基化和RNA转录组的差异化主要与肠道微生物群的存在与否相关。图5微生物可通过DNA甲基化调节宿主基因表达。 A.分析流程。每一个微生物调控基因的上下游5-kb窗口被用于CpG筛选。接下来，确定CpG区域，寻找差异甲基化位点(CONV-R vs GF)，并对所有差异甲基化CpG位点的P值进行校正。B. 在出生后发育过程中微生物对CAMK2B基因表达和DNA甲基化的影响。C. 依赖于微生物和出生后发育过程的所有甲基化-转录相互作用的基因组图谱。外圈中的框描绘了小鼠染色体，其条带表明基因组内的染色特性（黑色=异染色质区，白色=常染色质区，灰色＝中间）。内圈中的框代表差异表达和甲基化的基因。基因名称根据CONV-R vs GF比较的表达差异着色（红色＝上调，蓝色＝下调）。框着色对应于发育阶段（红色= W1，绿色＝W4，蓝色＝W12／16）。盒的宽度指示基因长度，而在CONV-R vs GF比较中的甲基化差异程度随着框的高度缩放。基因框中的红色和蓝色点分别代表CpG位点甲基化的高低。图6 甲基化和转录组数据的整合分析确定了126个基因组位点，这些位点的DNA甲基化和RNA转录组的差异化主要与肠道微生物群的存在与否相关。网络分析基于出生后三个发展阶段中CONV-R vs GF比较得到的差异甲基化和差异表达基因，置信度大于0.6。较大的蓝圆表示从分析中识别出的候选基因，较小的黑圈表示相互作用的基因。

◆ 在一个独立的小鼠队列中验证了一组差异表达和差异甲基化的基因集，表明存在依赖于微生物的“功能性”甲基化位点，这些位点可能影响肠上皮细胞的部分基因表达特征。

结 论

本研究第一次从基因组范围内调查了出生后肠上皮细胞中微生物对DNA甲基化和转录过程的影响。结果表明肠道微生物在出生后发育过程中动态调节大部分上皮细胞基因的转录水平，但通过这些基因的DNA甲基化状态只靶向调控一小部分微生物应答基因。

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